Визначення концентрації сперміїв за допомогою фотоелектроколориметра
Визначення концентрації сперміїв за допомогою фотоелектроколориметра ґрунтується на здатності сперми послаблювати інтенсивність потоку світла, який пропускають через неї пропорційно концентрації сперміїв. Отже, що вища концентрація сперміїв, то більше послаблюється інтенсивність потоку світла, який проходить через неї. Величина послаблення світла реєструється чутливими фотоелементами. Найбільш придатні для даної мети вітчизняні прилади - фотоелектричний колориметр ФЕК-56М та інші його типи.
Для визначення концентрації сперміїв необхідно мати:
3,5%-ний розчин цитрату натрію тризаміщеного п'ятиводного;
мікропіпетки об'ємом 0,1 та 0,2 мл;
піпетку градуйовану на 10 мл;
чисті сухі флакони з пробками з-під пеніциліну або інших антибіотиків;
марлеві серветки для протирання кювет та мікропіпеток;
фільтрувальний папір (нарізаний квадратиками 5x6 см);
суміш спирту з ефіром (у рівних частинах);
промивалку на 0,5 л, наповнену дистильованою водою, для промивання кювет після кожного дослідження;
посуд для споліскування об'ємом 0,5 літра.
Перш ніж приступити до роботи з приладом, необхідно уважно вивчити заводську інструкцію, яка додається до нього. Після цього потрібно привести прилад у робочий стан і настроїти згідно з Інструкцією.
Порядок роботи:
поставити зелений світлофільтр;
увімкнути прилад у мережу і прогріти 15 хвилин;
наповнити дві кювети з робочою довжиною грані 10 мм 3,5%-ним розчином лимоннокислого натрію до відмітки;
помістити кювети в праве та ліве гнізда приладу;
правий барабан установити за шкалою оптичної щільності (червоні цифри) в положення "0";
поставити ручку перемикача чутливості гальванометра (на лівому боці приладу) у положення "1";
гвинтом грубої наводки (передня ліва сторона приладу) встановити стрілку гальванометра орієнтовно на "0";
поставити перемикач у положення "2", гвинтами грубої та тонкої наводки встановити стрілку гальванометра точно на "0";
перемикач чутливості поставити в положення "0";
у пеніциліновий флакон налити піпеткою 12 мл 3,5%-ного розчину лимоннокислого натрію, добавити 0,4 мл профільтрованої сперми і старанно перемішати, при цьому досягається розбавлення сперми 1:30;
заповнити третю кювету з робочою довжиною грані 10 мм на дві третини спермою, розбавленою розчином лимоннокислого натрію, як зазначено вище, і поставити її на місце правої кювети в приладі;
перемикач чутливості поставити в положення "1" і з допомогою барабана встановити стрілку гальванометра орієнтовно на "0";
перемикач чутливості поставити в положення "2" і з допомогою барабана встановити стрілку гальванометра точно на "0";
відлік вести за червоною шкалою правого барабана: цифра, яка стоїть проти риски, указуватиме на величину оптичної щільності.
Побудова калібрувальної кривої. Для визначення концентрації сперміїв приладом ФЕК-56М необхідно передусім побудувати калібрувальну криву, яка зображає залежність оптичної щільності від концентрації сперміїв.
З цією метою з одержаних еякулятів вибирають кілька таких, у яких концентрація сперміїв найбільш висока. Старанно визначають концентрацію сперміїв у лічильній камері. З відібраних еякулятів шляхом розбавлення 3,5%-ним розчином лимоннокислого натрію 1:1; 1:2; 2:3 і т.ін. готують ряд зразків сперми (не менше 5-6 еталонів) і уточнюють концентрацію сперміїв у кожному з них з допомогою лічильної камери. Визначають оптичну щільність кожного зразка на приладі, як описано вище. За фактичною концентрацією сперміїв, установленою в лічильній камері, накреслюють калібрувальну криву. Для цього на міліметровому папері відкладають по горизонтальній осі відповідні їм величини оптичної щільності, а по вертикальній - концентрацію сперміїв, визначену з допомогою камери Горяєва. У місцях перетину перпендикулярів ставлять крапки. Калібрувальну криву проводять так, щоб вона пройшла через більшість зазначених крапок, а число крапок, які лежать вище і нижче калібрувальної кривої, має бути приблизно однаковим.
Крива не повинна бути сильно вигнутою або ламаною, а більш-менш наближатися до прямої лінії.
Маючи калібрувальну криву, можна легко визначити невідому концентрацію сперміїв будь-якого еякуляту. Для цього потрібно лише визначити його оптичну щільність на приладі, як зазначено вище, і подивитись, якій концентрації вона відповідає на калібрувальній кривій. При цьому потрібно суворо дотримуватися усіх умов дослідження, при яких виведена калібрувальна крива. Потрібно застосовувати ту саму кратність розбавлення сперми, використовувати кювети з тією самою довжиною робочої поверхні і такі самі світлофільтри, які використовували при побудові калібрувальної кривої.
Калібрувальну криву потрібно щомісяця перевіряти, оскільки показання приладу можуть змінюватися (зношуються фотоелементи, лампи розжарювання та гальванометр).