Організація та здійснення комплексного дослідження матеріалу з використанням ПЛР з детекцією методом гібридизації на стрипах з типоспецифічними зондами. ПТЗ, які мають відповідно обладнані ПЛР-лабораторії та влаштовані з дотриманням чинного законодавства, а також мають підготовлений персонал, можуть використовувати ПЛР з детекцією методом гібридизації на стрипах з типоспецифічними зондами для виявлення M. tuberculosis complex, ідентифікації збудника захворювання та визначення наявності мутацій у генах, з якими пов’язана резистентність до R та H, а також до препаратів 2-го ряду.
Реагенти GenoType MTBDRplus та GenoType MTBDRsl виробництва компанії HainLifescience, дозволені до використання в Україні відповідно до чинного законодавства, можуть давати коректний достовірний результат з біологічним матеріалом та бактеріальними культурами, які виросли на рідкому або щільному середовищі.
Набір GenoType MTBDRplus дає можливість виявити у пробі наявність ДНК M. tuberculosis complex, а також наявність мутацій, асоційованих з резистентністю до R та H. Якщо за результатами тестування матеріалу з наборами GenoType MTBDRplus виявлені мутації у генах, з якими пов’язують резистентність до препаратів 1-го ряду (а саме до рифампіцину та ізоніазиду), тестування може бути продовжене з набором GenoType MTBDRsl.
Дослідження з реагентами GenoType MTBDRsl дають можливість виявити наявність генних мутацій, що відповідають за резистентність M.tuberculosis complex до препаратів 2-го ряду - аміноглікозидів, циклічних пептидів, Q.
Під час проведення досліджень слід враховувати особливості використання наборів системи GenoType.
Висока якість досліджень за допомогою набору GenoType MTBDRplus гарантована за умови роботи з таким матеріалом: нативним або індукованим мокротинням (незалежно від результатів бактеріоскопії), бронхоальвеолярним лаважем, плевральними аспіратами, а також культурами, які виділені в рідкому або на щільному середовищах. Для наборів GenoType MTBDRsl як матеріал для дослідження потрібно використовувати мокротиння з позитивним результатом бактеріоскопії «КСП+» або культурами, які виділені в рідкому або на щільному живильному середовищі. Для інших видів матеріалу методика не валідована.
Під час роботи з біологічним матеріалом після проведення його деконтамінації з використанням реактиву NALС-NaOH, отриманий осад має бути ресуспендований в 1,0-1,5 мл фосфатного буфера (більші об’єми фосфатного буфера можуть негативно вплинути на чутливість тесту).
Після обробки та ресуспендування біологічного матеріалу потрібно виконати такі маніпуляції:
внести 0,5 мл підготовленого матеріалу до пробірки з рідким середовищем Мідлбрукка 7H9 для інкубації в аналізаторі ВАСТЕС MGIT 960;
внести 0,2 мл до пробірки зі щільним середовищем Левенштейна-Єнсена й помістити до термостата за температури +37 ° С;
якщо лабораторія за будь-яких під часчин не може виконати дослідження за допомогою системи ВАСТЕС MGIT 960, потрібно зробити посів на 2 пробірки із середовищем Левенштейна-Єнсена по 0,2 мл. Подальші маніпуляції з посівами слід здійснювати відповідно до вимог чинної Інструкції з бактеріологічної діагностики ТБ;
одну краплю матеріалу треба нанести на скельце з метою приготування та фарбування мазка за методом Ціля-Нільсена для світлової бактеріоскопії;
0,7 мл деконтамінованого зразка біологічного матеріалу (за використання автоматичного виділення ДНК на GenoXtract) або 0,5 мл зразка (для виділення ДНК за допомогою реагентів GenoLyse) переносять до пробірки об’ємом 2,0 мл з кришечкою, що загвинчується. Цю пробірку з матеріалом передають у приміщення виділення нуклеїнової кислоти для здійснення ПЛР дослідження відповідно до інструкції виробника реагентів.
Важливо пам’ятати, що для отримання коректного результату потрібно, щоб забраний матеріал був деконтамінований не пізніше ніж 48 год від моменту забору в пацієнта, у цьому разі зберігатися він може за температури +4 ± 2 ° C.
Набори реагентів GenoType MTBDRplus та GenoType MTBDRsl можуть бути використані для прискорення отримання лабораторної інформації щодо МЧ, виділених M. tuberculosis complex до ПТП.
Для виділення ДНК може використовуватись «ручна методика» за допомогою реагентів GenoLyse або автоматична - у приладі GenoXtract із набором реагентів GXT DNA/RNA ExtractionKit.
Під час роботи з культурами, які виросли в рідкому середовищі, потрібно перенести 500 мкл культури до чистої мікропробірки об’ємом 1,5-2,0 мл з кришкою, що загвинчується, і виділити ДНК відповідно до інструкції виробника для набору реагентів GenoLyse. Для виділення ДНК із цих культур за допомогою GenoXtract та реагентів GXT DNA/RNA ExtractionKit потрібно 700,0 мкл рідкої культури помістити до GenoXtract та запустити відповідну програму.
Під час роботи з культурами, вирощеними на щільному середовищі, потрібно перенести 1-2 колонії до 100 мкл лізуючого буфера, який входить до складу набору для ручного виділення ДНК GenoLyse, ретельно ресуспендувати їх і отриману завись мікроорганізмів використовувати для виділення нуклеїнової кислоти відповідно до інструкції виробника. Під час виділення ДНК із культур, які виросли на щільному середовищі, за допомогою GenoXtract та реагентів GXT DNA/RNA Extraction Kit потрібно до 700 мкл деіонізованої води для молекулярної біології внести 1-2 колонії мікроорганізмів, ретельно перемішати на вортексі, помістити до GenoXtract та запустити відповідну програму.
Для контролю якості етапу виділення ДНК потрібно обов’язково з кожною партією досліджуваних проб (10-12 зразків) ставити негативний контроль, у якості якого може бути використано стерильну дейонізовану воду, яку вносять до чистої пробірки і здійснюють із нею такі самі маніпуляції, як зі зразком.
Подальші етапи дослідження матеріалу в ПЛР із детекцією методом гібридизації на стрипах з типоспецифічними зондами виконують відповідно до інструкцій виробника.
Усі посіви матеріалу на живильні середовища, що були здійснені паралельно під час виконання комплексу досліджень даної проби, мають бути інкубовані в оптимальних температурних умовах. Культури, що виділені в рідкому та у щільному середовищах, підлягають обов’язковій ідентифікації та визначенню профілю резистентності до ПТП. Результати досліджень (бактеріоскопії, ідентифікації, ТМЧ, молекулярно-генетичних досліджень) заносять до журналу ТБ 04/2 та інформують про них фтизіатра для призначення та/або коригування схеми лікування хворого.