Найбільш ефективними методами діагностики МЧ M. tuberculosis визнано молекулярно-генетичні методи, які ґрунтуються на гібридизації з ДНК-зондами (LPA), зокрема GenoType MTBDRplus, GenoType MTBDRsl та INNO-LiPA Rif TB Assay.
Технологія проведення досліджень із використанням цих методів охоплює такі етапи:
виділення ДНК з культур M. tuberculosis або безпосередньо з клінічного матеріалу;
ПЛР для ампліфікації фрагментів генів, що асоціюються з медикаментозною стійкістю мікобактерій;
гібридизація ПЛР-продуктів з ДНК-зондами;
візуалізація результатів гібридизації, за якої відбувається детекція мікобактерій комплексу M. tuberculosis, а також наявність або відсутність мутацій у дослідних генах.
До складу зондів належать специфічний зонд для ідентифікації мікобактерій комплексу M. tuberculosis, зонди «дикого типу» (без мутацій, WT), а також зонди для детекції мутацій (MUT), що найчастіше зустрічаються. Заміна хоча б одного нуклеотиду в послідовності ДНК-мішені призводить до порушення гібридизації із зондом, комплементарним відповідній ділянці ДНК-мішені «дикого типу», але при цьому відбувається гібридизація із зондом, що враховує цю заміну. Наявність мутацій визначається відсутністю сигналу одного або кількох зондів «дикого типу», а також наявністю сигналів від одного або кількох «мутантних» зондів. Також можливе виявлення гетерорезистентних штамів мікобактерій, у яких реєструються всі сигнали зондів «дикого типу» і один або кілька сигналів «мутантних» зондів.
Резистентність може існувати, незважаючи на наявність структури не мутантного типу. Можливі під причини гетерорезистентності: досліджуваний зразок містить штам, який має гетерорезистентність, викликану мутацією, яка не була виявлена мутаційними зондами, або досліджуваний зразок містить штам немутантного типу та резистентний штам (наприклад, внаслідок змішаної інфекції пацієнта), і ця резистентність викликана мутацією, яка не була виявлена мутаційними зондами.
Молекулярно-генетичні методи детекції мультирезистентних M.tuberculosis в цілому спрямовані на виявлення мутацій, що обумовлюють резистентність M. tuberculosis до рифампіцину (який є маркером множинної медикаментозної стійкості мікобактерій, оскільки резистентність до рифампіцину у 80,0-90,0 % штамів M. tuberculosis корелює зі стійкістю до ізоніазиду), а також до ізоніазиду. Генодіагностика резистентності до R ґрунтована на детекції мутацій, локалізованих у висококонсервативній області розміром 81 п.о. гена rpoB, що кодує β -субодиницю РНК-полімерази, оскільки 95,0-98,0 % стійких до R штамів M. tuberculosis мають мутації в цьому гені. Для визначення високого рівня стійкості до H досліджують ген katG, що кодує каталазу-пероксидазу; для визначення низького рівня стійкості до H вивчають область промотора гена inhA, що кодує еноілацил-протеінредуктазу. Діагностичні набори, наприклад GenoType MTBDRsl, дають можливість проводити визначення стійкості до Q (gyrA) аміноглікозидів/циклопептидів (rrs), тобто експрес-детекцію широкої медикаментозної стійкості.
Молекулярно-генетичні тести для визначення МЧ M. tuberculosis (за винятком Xpert MTB/RIF) рекомендують використовувати в обласних лабораторіях.
Новий швидкий і ефективний метод діагностики ТБ - тест GeneXpert MTB/RIF, що дає можливість проводити детекцію M. tuberculosis у зразку діагностичного матеріалу й чутливості до R за дві години. Усі стадії тесту повністю автоматизовані. Екстракція, ампліфікація і детекція ДНК здійснюються автоматично в закритому картриджі, що мінімізує можливість крос-контамінації.
Проведення дослідження є двоступінчастим процесом, що охоплює обробку клінічних зразків і власне ПЛР у режимі реального часу, під час якої відбувається ампліфікація специфічної послідовності гена rpoB, яка потім тестується молекулярними маяками (molecular beacons) на мутації в ділянці, що обумовлює стійкість до R. Рекомендується використання методики Xpert MTB/RIF для швидкого виявлення MDR-туберкульозу в бактеріологічних лабораторіях ПТЗ і мікроскопічних пунктах у районах із високим рівнем захворюваності на ТБ.
На відміну від попередньої версії Xpert MTB/RIF, для підвищення чутливості тесту картридж Xpert MTB/RIF Ultra, крім гена rpoB, включає дві різні мультикопійні мішені ампліфікації (IS6110 і IS1081), а також у ньому використовується більша реакційна камера (50,0 мкл ПЛР-реакції в Xpert MTB/RIF Ultra порівняно з 25,0 мкл в Xpert MTB/RIF). У нових картриджах Xpert MTB/RIF Ultra використовується повністю вкладена ПЛР, швидше термоциклювання (отримання негативного результату за 65 хв, позитивного - за 77 хв), а також поліпшені розчини та ферменти.
Xpert MTB/RIF Ultra має межу виявлення 11,8 КУО/мл, тоді як для Xpert MTB/RIF межу виявлення встановлено на рівні 114 КУО/мл, тобто нова система майже в 10 разів чутливіша.
Для підвищення точності виявлення стійкості до R у тесті Xpert MTB/RIF Ultra використано аналіз температури плавлення замість аналізу кривих флуоресценції ПЛР у реальному часі. Для визначення мутацій, що характеризують стійкість до R, використовуються чотири зонди, які визначають область гена rpoB.
У тесті Xpert MTB/RIF Ultra для оцінювання результату використовуються такі самі напівкількісні категорії, що і в Xpert MTB/RIF аналізі (високий, середній, низький і дуже низький), а також додано нову напівкількісну категорію «одиничні MБТ», яка відповідає найнижчому бактеріальному навантаженню. Результат «MБТ виявлено, одиничні» було додано для підвищення ефективності виявлення M. tuberculosis complex.
Xpert MTB/RIF Ultra не поступається Xpert MTB/RIF аналізу для діагностики MБТ і виявлення стійкості до R і може бути використаний як альтернатива останньому.
Xpert MTB/RIF Ultra потребує програмного забезпечення GeneXpert версії 4.7b або вище.
Xpert MTB/RIF Ultra потрібно використовувати як початковий діагностичний тест для дорослих і дітей з ознаками і симптомами легеневого ТБ, а також у тестуванні позалегеневих зразків (спино-мозкова рідина, біоптати лімфатичних вузлів і тканин). Інтерпретація результатів Xpert MTB/RIF Ultra для виявлення M. tuberculosis complex є такою самою, як і для Xpert MTB/RIF, за винятком «MБТ виявлено, одиничні». Інтерпретувати «MБТ виявлено, одиничні» потрібно так:
для ВІЛ-інфікованих осіб і дітей із підозрою на захворювання на легеневий ТБ, а також для позалегеневих зразків від хворих цієї категорії результат «MБТ виявлено, одиничні» слід розглядати як позитивний результат для використання в клінічних рішеннях і подальших дій щодо пацієнта;
для осіб без ризику інфікування ВІЛ, які мають початковий позитивний результат «MБТ виявлено, одиничні», потрібно зібрати свіжий зразок і повторно протестувати матеріал. Результат другого тесту Xpert MTB/RIF Ultra використовується для під часйняття клінічних рішень і подальших діях щодо пацієнта;
для усіх інших пацієнтів, які отримали позитивний результат первинного початкового тесту Xpert MTB/RIF Ultra «MБТ виявлено, одиничні», потрібні додаткові дослідження, щоб підтвердити або виключити стійкість до R.