Стандартні концентрації препаратів II ряду для використання в системі ВАСТЕС МGIТ 960 (мкг/мл): Lfx - 1,0; Mfx - 0,25 і 1,0; Ofх - 2,0; Am - 1,0; Km - 2,5; Cm - 2,5; Et - 5,0; Pt - 2,5; Lzd - 1,0; Cfz - 1,0; Bdq - 1,0; Dlm - 0,06.
Розчинення препаратів другого ряду і підготовка пробірок із рідким середовищем для постановки ТМЧ (додаток 10) процедури здійснюють у ШББ.
Розведення протитуберкульозних препаратів готують із ХЧ субстанцій препаратів II ряду з використанням стерильної дистильованої води чи інших розчинників.
Схема процедур:
Левофлоксацин (Lfx) - 1,0 мкг/мл:
8,4 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH = 840 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 84,0 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Моксифлоксацин (Мfx) - 1,0 мкг/мл:
16,8 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH = 1 680 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,0 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл стерильної дистильованої води = 84,0 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Моксифлоксацин (Мfx) - 0,25 мкг/мл:
Для приготування концентрації Mfx 0,25 мкг/мл використовуємо третє розведення, що було нами отримано під час приготування концентрації 1,0 мкг/мл (див. вище);
1,0 мл третього розведення з концентрацією Mfx 84,0 мкг/мл + 3,0 мл стерильної дистильованої води = 21,0 мкг/мл;
внести 0,1 мл розведення 21,0 мкг/мл до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 0,25 мкг/мл.
Амікацин (Am) - 1,0 мкг/мл:
16,8 мг активної речовини чистої субстанції препарату (амікацин сульфат) + 10,0 мл дистильованої води = 1 680 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,0 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл стерильної дистильованої води = 84,0 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Канаміцин (Km) - 2,5 мкг/мл:
10,5 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 5,0 мл стерильної дистильованої води = 2 100 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 210 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 2,5 мкг/мл.
Капреоміцин (Cm) - 2,5 мкг/мл:
10,5 мг активної речовини чистої субстанції препарату (капреоміцин сульфат) + 5,0 мл стерильної дистильованої води = 2 100 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 210 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 2,5 мкг/мл.
Етіонамід (Et) - 5,0 мкг/мл:
21,0 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 5,0 мл димексиду (DMSO) = 4 200 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 420,0 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 5,0 мкг/мл.
Протіонамід (Pt) - 2,5 мкг/мл:
10,5 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 5,0 мл DMSO = 2 100 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 210 мкг/мл (друге розведення);
внести 0,1 мл другого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 2,5 мкг/мл.
Лінезолід (Lzd) - 1,0 мкг/мл:
4,9 мг активної речовини чистої субстанції препарату (наважка 5,0 мг – вміст упаковки) + 2,9 мл стерильної дистильованої води = 1 689 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,9 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл дистильованої води = 84,5 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Клофазимін (Cfz) - 1,0 мкг/мл:
16,8 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 10,0 мл димексиду (DMSO) = 1 680 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 168,0 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл DMSO = 84,0 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Бедаквілін (Bdq) - 1,0 мкг/мл:
4,9 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 2,9 мл димексиду (DMSO) = 1 689 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл DMSO = 168,9 мкг/мл (друге розведення);
2,0 мл другого розведення + 2,0 мл DMSO = 84,5 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,1 мл третього розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 1,0 мкг/мл.
Деламанід (Dlm) - 0,06 мкг/мл:
4,9 мг активної речовини чистої субстанції препарату + 2,9 мл димексиду (DMSO) = 1 689 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 168,9 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 7,0 мл дистильованої води = 21,1 мкг/мл (третє розведення);
1,0 мл третього розведення + 3,0 мл дистильованої води = 5,28 мкг/мл (четверте розведення);
внести 0,1 мл четвертого розведення до 7,8 мл вмісту пробірки MGIT; кінцева концентрація в рідкому середовищі - 0,06 мкг/мл.
Промаркувати пробірки, зазначаючи на них номер зразка, найменування препарату й призначення пробірки.
9. Для постановки ТМЧ для одного штаму M. tuberculosis до препаратів II ряду потрібно підготувати п’ять пробірок: один контроль і чотири пробірки з препаратами II ряду (або вісім пробірок: один контроль і сім пробірок із препаратами II ряду залежно від того, чи має лабораторія штативи для ВАСТЕС MGIT 960 до ТМЧ II ряду на 8 гнізд.)
За допомогою піпетки зі стерильним наконечником додати по 800 мкл відповідних добавок до пробірок із препаратами й до контрольних пробірок, а добавку SIRE - до контролю та пробірок із Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz.
За допомогою піпетки зі стерильним наконечником додати 100 мкл розчину препаратів (Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz) до відповідних маркованих пробірок МGIT.
Не додавати препаратів до пробірок, які буде використано для контролю росту мікобактерій.
Для постановки ТМЧ для одного штаму M. tuberculosis до препаратів I та II ряду (додаток 11) потрібно використовувати 15 пробірок: 1 пробірка - контроль для препаратів I ряду (штатив із препаратами I ряду), 1 пробірка - контроль II ряду (штатив із препаратами II ряду), 1 пробірка - контроль Z, 12 пробірок із препаратами (SIRE та S, H, R, E, Z, Cm, Lfx, Lzd, Am, Mfx, Bdq і Cfz).