Суть методу визначення медикаментозної чутливості мікобактерій до протитуберкульозних препаратів непрямим методом абсолютних концентрацій на щільному середовищі Левенштейна-Єнсена полягає в тому, що здійснюють дозований посів ретельно підготовленої мікобактеріальної суспензії з культури M. tuberculosis в пробірки із живильним середовищем Левенштейна-Єнсена, що містить певні концентрації ПТП і контрольні пробірки без препаратів. Зазвичай використовується «критична» концентрація препаратів, яка є критерієм стійкості, пригнічує ріст всіх або майже всіх мікобактерій, що визначається як наявність 20 або менше колоній збудника та дає можливість визначити культуру M. tuberculosis як чутливу або стійку до цього ПТП.
Для дослідження МЧ мікобактерій до ПТП застосовують щільне яєчне середовище Левенштейна-Єнсена. Після додавання препарату до середовища потрібно ретельно його перемішати, не допускаючи утворення бульбашок і піни та забезпечуючи рівномірний розподіл препарату в середовищі. Згортання середовища з препаратом має проводитися в тих самих умовах, що й середовища без препарату. Згортання проводять за температури 85 ° C протягом 30 хв.
Середовища, що входять до набору для тестування першого штаму, мають готуватися з однієї партії середовища Левенштейна-Єнсена в один день.
На кожній пробірці із середовищем надписують номер культури і назву препарату. Для зручності подальшого обліку результатів дослідження МЧ мікобактерій рекомендують виконувати написи на верхній частині пробірки зі сторони, де знаходиться нахил живильного середовища. Крім того, пробірки з кожного набору середовищ слід розміщувати в штативах в однаковій послідовності (відповідно до граф лабораторного журналу).
Приготування живильних середовищ із препаратами та розведення здійснюють так само, як під час визначення МЧ мікобактерій за методом пропорцій.
Готують гомогенну бактеріальну суспензію в ізотонічному розчині натрію хлориду. Для цього культура, що виросла на твердому живильному середовищі Левенштейна-Єнсена, знімається тампоном, попередньо змоченим у стерильному ізотонічному розчині натрію хлориду. При цьому тампон має торкатися всієї поверхні середовища. Потім тампон занурюють у пробірку, що містить 2,0 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, культуру змивають у рідину, попередньо розтираючи по внутрішніх стінках пробірки. Пробірку залишають на 30 хв за кімнатної температури для осадження крупних часточок культури.
Суспензію культури стандартизують за бактеріальним стандартом мутності (1 McF). Для цього суспензію (без осаду) обережно, не торкаючись дна пробірки, відсмоктують піпеткою до іншої пробірки з ізотонічним розчином натрію хлориду.
Із цієї суспензії готують таке розведення:
1 : 10 (10 -1 ) контроль 1(К 1 ) (4,5 мл 0,9 % розчину NaCl + 0,5 мл суспензії 1 McF).
Із суспензії з мутністю 1 McF вносимо по 0,2 мл бактеріологічної суміші до контролю (К 1 ). Із розведення 10 -1 вносимо по 0,2 мл бактеріологічної суміші до всіх пробірок із препаратами. Кожну пробірку із засіяною суспензією закривають кришками, що загвинчуються, і ставлять у вертикальний штатив, щоб за час досліду суспензія рівномірно стікала по поверхні косяка середовища до дна пробірки.
Після закінчення посіву всіх суспензій засіяні пробірки переміщають у горизонтальні штативи і поміщають для інкубації в термостат за температури 37 ° C. При цьому поверхня косяка живильного середовища має знаходитися в горизонтальній площині, а нахил штатива має виключати торкання пробки до матеріалу засіву. Суспензія, що засівається, має рівномірно покривати всю поверхню косяка середовища.
Через дві доби можна перевести пробірки у вертикальні штативи, проте ця процедура не носить обов’язкового характеру.
Оцінення результатів визначення МЧ M. tuberculosis до ПТП проводять через три тижні інкубації в термостаті. У разі поганого росту МБТ на контрольному живильному середовищі слід почекати ще 1-2 тижні до отримання вираженого росту в контролі, після чого видається остаточна відповідь.
Під час використання методу абсолютних концентрацій культура M. tuberculosis вважається стійкою, якщо на живильному середовищі з певним препаратом виростає 20 і більше колоній мікроорганізмів у разі рясного росту в контрольній пробірці (без препарату).