Для приготування розведень протитуберкульозних препаратів використовують ХЧ субстанції препаратів.
Схема процедур:
ізоніазид (Н) - 0,2 мкг/мл;
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення). Під час приготування наважки кожного з препаратів I та II ряду потрібно враховувати потенцію ПТП, яка залежить від фірми-виробника й хімічного складу ХЧ субстанції препарату. Щоразу потрібно робити відповідне перерахування на вміст активної речовини ХЧ субстанції препаратів;
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100,0 мкг/мл (третє розведення);
1,0 мл третього розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 10,0 мкг/мл (четверте розведення);
внести 1,0 мл четвертого розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 0,2 мкг/мл.
Рифампіцин (R) - 40,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 2,0 мл етилового спирту + 8,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл;
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Етамбутол (E) - 2,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл;
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100 мкг/мл (третє розведення);
внести 1,0 мл третього розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 2,0 мкг/мл.
Стрептоміцин (S) - 4,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 4,0 мл стерильної дистильованої води = 200 мкг/мл (третє розведення);
внести 1,0 мл третього розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання), кінцева концентрація в середовищі - 4,0 мкг/мл.
Амікацин (Аm) - 30,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 1,5 мл другог розведення до 48,5 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання), кінцева концентрація в середовищі - 30,0 мкг/мл.
Канаміцин (Кm) - 30,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 1,5 мл другого розведення до 48,5 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 30,0 мкг/мл.
Капреоміцин (Cm) - 40,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Eтіонамід (Et) - 40,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 2,0 мл димексиду (DMSO) + 8,0 мл дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Протіонамід (Pt) - 40,0 мкг/мл:
50,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл димексиду (DMSO) + 8,0 мл дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
внести 2,0 мл другого розведення до 48,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 40,0 мкг/мл.
Левофлоксацин (Lfx) - 2,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH= 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100 мкг/мл (третє розведення);
внести 1,0 мл третього розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 2,0 мкг/мл.
Моксифлоксацин (Mfx) - 1,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл 0,1 N NaOH** = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл (друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100 мкг/мл (третє розведення);
внести 0,5 мл третього розведення до 49,5 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 1,0 мкг/мл.
ПАСК (Pas) - 1,0 мкг/мл:
100,0 мг активної речовини ХЧ субстанції препарату + 10,0 мл стерильної дистильованої води = 10 000 мкг/мл (перше розведення);
1,0 мл першого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 1 000 мкг/мл друге розведення);
1,0 мл другого розведення + 9,0 мл стерильної дистильованої води = 100,0 мкг/мл (третє розведення);
3,0 мл третього розведення + 3,0 мл стерильної дистильованої води = 50,0 мкг/мл (четверте розведення);
внести 1,0 мл четвертого розведення до 49,0 мл рідкого середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання); кінцева концентрація в середовищі - 1,0 мкг/мл.
Готують гомогенну бактеріальну суспензію культури M. tuberculosis в ізотонічному розчині натрію хлориду. Для цього культура, що виросла на щільному живильному середовищі Левенштейна-Єнсена, знімається тампоном, попередньо змоченим у стерильному ізотонічному розчині натрію хлориду. При цьому тампон має торкатися всієї поверхні середовища. Потім тампон занурюють у пробірку, що містить 2,0 мл стерильного ізотонічного розчину натрію хлориду, культуру змивають в рідину, попередньо розтираючи по внутрішніх стінках пробірки. Пробірку залишають на 30 хв за кімнатної температури для осадження крупних часточок культури.
Суспензію культури стандартизують за бактеріальним стандартом мутності МакФарланда (1 McF) (додаток 7).
Як стандарт мутності МакФарланда застосовують суспензію слаборозчинної у воді солі сульфату барію. Для її приготування використовують такі два розчини: BaCl 2 × 2H 2 O - 1,0 % розчин і H 2 SO 4 - 1,0 % розчин.
Для отримання суспензії потрібної мутності змішують розчини хлориду барію і сірчаної кислоти в певних пропорціях.
Стабільність стандарту МакФарланда - шість місяців за зберігання в темряві.
Останнім часом у лабораторіях, у тому числі й в Україні, широко застосовують сучасні оптичні прилади для зручного і швидкого визначення мутності бактеріальної суспензії. Принцип роботи такого приладу - оптична абсорбція з видачею результатів вимірювання в одиницях за МакФарландом.
Процедура приготування суспензії (додаток 8) призводить до утворення інфекційного аерозолю. Вона має проводитися тільки з використанням товстостінних (переважно боросилікатних) пробірок без видимих пошкоджень. Процедура має проводитися в ШББ другого класу.
Із розведення 10 -2 вносимо по 0,1 мл бактеріальної суміші до одного з двох контролів (К 1 ) і до всіх пробірок із препаратами. Кінцева концентрація бактеріальної суміші в пробірках, що засіяні, дорівнює 10 -3 .
Із розведення 10 -4 вносимо по 0,1 мл бактеріальної суміші до другого контролю (К 2 ). У пробірках із середовищем кінцева концентрація бактеріальної суспензії дорівнює 10 -5 .
Після закінчення посіву засіяні пробірки переміщають у горизонтальні штативи і поміщають для інкубації в термостат за температури 37 ° C. При цьому поверхня скосу живильного середовища має знаходитись у горизонтальній площині, а нахил штатива має виключити торкання пробки з матеріалом посіву. Суспензія, що засівається, має рівномірно покривати всю поверхню скосу середовища.
Через дві доби можна перевести пробірки у вертикальні штативи, проте ця процедура не носить обов’язкового характеру.
Посіви переглядають щотижня. За наявності росту в контрольних пробірках через чотири тижні після посіву (щонайменше - шість тижнів) реєструють отримані результати. Кількість колоній, що виросли в контрольній пробірці К 1 (вихідне розведення мікробної суспензії - 1 : 100), приймається за 100 %; кількість колоній, що виросли в К 2 , відповідає 1,0 % усіх бактерій популяції.
Якщо в контрольних пробірках К 1 і К 2 під час посіву досліджуваного штаму M. tuberculosis спостерігається ріст відповідно до вищезазначених пропорцій (100 : 1), можна робити облік результатів стійкості в пробірках із препаратами. Інтенсивність росту в контролях і в пробірках із препаратами оцінюють:
культура M. tuberculosis є «чутливою», якщо в пробірці з «критичною» концентрацією препарату немає росту або кількість колоній менша, ніж у контролі К 2 з 1,0 % бактеріальної популяції;
культура M. tuberculosis є «стійкою», якщо в пробірці з «критичною» концентрацією препарату виросло більше колоній, ніж у контролі К 2 із 1,0 % бактеріальної популяції.
Дослідження потрібно повторити, якщо:
немає пропорційності росту між К 1 і К 2 ;
відсутній ріст у К 1 і К 2 або в одній із контрольних пробірок;
К 1 , К 2 або один із них забруднено;
забруднено пробірки з препаратами.