Для ідентифікації М. tuberculosis користуються також реакцією відновлення нітратів у нітрити. Реакція відновлення нітратів дає можливість диференціювати М. tuberculosis, які мають нiтратредуктазу, від М. bovis, М. avium і від деяких НТМБ, у яких цей фермент відсутній. Виняток становлять фотохромогенні мікобактерії (М. kansasii) та деякі з III і IV груп.
Активність нiтратредуктази визначається за кількістю відновленого з нітрату нітриту, що дає кольорову реакцію з пара-диметиламінобензальдегідом.
Реактиви:
0, 067 М фосфатний буфер (рН-7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію;
2,0 % розчин (вага/об’єм) пара-диметиламінобензальдегіду в 10,0 % НCl;
10,0 % розчин НCl.
Для реакції використовують 3-4-тижневі культури, вирощені на яєчному середовищі.
Хід дослідження: 2 петлі біомаси 3-4-тижневої культури суспендують у 5,0 мл (можна суспендувати 10,0 мг культури в 1,0 мл) 0,067 М фосфатного буферу (рН-7,1), що містить 0,1 % нітрату натрію, й інкубують за температури 37 ° C 15-16 год. Утворення нітриту перевіряється додаванням 2 крапель 2,0 % розчину пара-диметиламінобензальдегіду до 10,0 % НCl + 1,0 мл 10,0 % НCl. Поява жовтого забарвлення свідчить про належність культури до М. tuberculosis (метод Тсукамура).
Крім активності зазначених ферментів, для відрізнення М. tuberculosis від інших кислотостійких мікобактерій можна використовувати різну активність окисно-відновних ферментів.
M. tuberculosis резистентні до ТСН і дають хороший ріст на середовищі з гідразид- тіофен-2-карбоксиловою кислотою. M. bovis і M. bovis-BCG чутливі до ТСН і не ростуть на середовищі, що містить цю сполуку.
Реактиви:
середовище Левенштейна-Єнсена - 600 мл (до згортання);
гідразид-тіофен-2-карбоксилової кислоти.
Приготувати наважку ТСН 20,0 мг, розчинити у 20,0 мл стерильної дистильованої води. Одержали розведення 1 000 мкг/мл (розчин А). До 12,0 мл стерильної дистильованої води додати 3,0 мл розчину А. Отримали розведення 200 мкг/мл (розчин Б).
Приготування середовища Левенштейна-Єнсена з ТСН:
1) розведення - 199 мл середовища + 1,0 мл розчину Б - розведення 1,0 мкг/мл;
2) розведення - 195 мл середовища + 5,0 мл розчину Б - розведення 5,0 мкг/мл;
3) контрольна пробірка із середовищем без реактиву.
Досліджуване і контрольне середовище розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури 85 ° C протягом 30 хв.
По 0,2 мл культури в стандартному розведенні засівається на поверхню середовища. Інкубація за температури 37 ° C. Перегляд росту культур через 3-4 тижні. Визначення чутливості мікобактерій до ТСН проводиться одночасно з визначенням їх стійкості до медикаментозних препаратів.
Метод використовується для диференціації мікобактерій туберкульозного комплексу. М. tuberculosis стійкі до всіх концентрацій ТСН, M. bovis чутливі до ТСН у концентрації 1,0 і 5,0 мкг/мл (слід пам’ятати, що M. bovis іноді дають слабкий ріст на середовищі з концентрацією 1,0 мкг/мл, але ніколи не ростуть на середовищі з 5,0 мкг/мл). M. bovis-BCG чутливі до всіх досліджуваних концентрацій.