Для приготування до наважки натрію саліциловокислого 50,0 мг потрібно додати 1,0 мл етилового спирту для дезінфекції, 2,0 мл стерильної дистильованої води та 97,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена (до згортання). Ретельно розмішати. Середовище із вмістом 500 мкг/мл саліциловокислого натрію розлити в пробірки по 5,0 мл і згортувати за температури +85 ° C протягом 30 хв.
Реактиви:
середовище Левенштейна-Єнсена з 500 мкг/мл ПНБК - 100 мл (до згортання);
ПНБК - 50,0 мг;
4,0 % розчин NaOH;
10,0 % розчин HCl.
Для приготування наважку ПНБК (50,0 мг) потрібно ретельно розтерти в стерильній ступці, додати 1,0 мл етилового спирту, 4,0 мл дистильованої стерильної води і 20-24 краплі 4,0 % розчину NaOH до отримання рН 8,0 (за індикаторним папірцем). За допомогою 10,0 % розчину HCl довести рН до 7,0 (додати 1-2 краплі). Приготований розчин додати до 95,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена, ретельно розмішати. Середовище з 500 мкг/мл ПНБК розлити в пробірки по 5,0 мл, згортати за температури +85 ° C протягом 30 хв.
M. tuberculosis та M. bovis чутливі до тіоацетазону (тіосемікарбазону пара-ацетамінобензальдегіду), тоді як інші мікобактерії, за винятком M. kansasii, до нього стійкі.
Реактиви:
тіоацетазон (тібон) - 10,0 мг;
Етиловий спирт 96°.
Готують розчин тіоацетазону з 1 000 мкг/мл препарату. Для цього до наважки 10,0 мг тібону, висипаної у пробірку, додають 1,0 мл етилового спирту і 9,0 мл стерильної дистильованої води. Отримують розведення 1 000 мкг/мл. 1,0 мл цього розведення додають до 99,0 мл середовища Левенштейна-Єнсена, одержують концентрацію тібону 10,0 мкг/мл і розливають у пробірки по 5,0 мл. Середовище в пробірках згортають у скошеному вигляді за температури 85 ° C протягом 30 хв.
Для диференціації M. tuberculosis complex і нетуберкульозних мікобактерій 0,1 мл бактеріальної суспензії дослідної культури в стандартному розведенні 10-2 засіяти на середовище із саліциловокислим натрієм або на середовище з ПНБК. Визначення здатності росту мікобактерій на одному із цих діагностичних середовищ проводиться одночасно з визначенням їх стійкості до протитуберкульозних препаратів.
M. tuberculosis complex не ростуть на середовищах із саліциловокислим натрієм та ПНБК, а також із тіоацетазоном (тібоном). Ця властивість слугує для диференціації M. tuberculosis та M. bovis від нетуберкульозних мікобактерій.
У деяких випадках під час постановки тесту спостерігається почорніння, побуріння середовища із саліциловокислим натрієм без зміни кольору середовища в контролі. Здатність викликати деградацію саліциловокислого натрію є відмітною особливістю M. fortuitum і M. сhelonae.
Метод ґрунтується на здатності нетуберкульозних мікобактерій V групи рости на середовищі з 5,0 % NaCl. Крім цієї групи, на такому середовищі ростуть тільки М. terrae complex (містить М. triviale, М. terrae, М. nonchromogenicum і М. flavescens, а також деякі мікобактерії I групи (М. marinum). Усі інші мікобактерії, у тому числі М. tuberculosis і М. bovis, на цьому середовищі не ростуть.
Інгредієнти:
NaCl;
сольова основа середовища Левенштейна-Єнсена;
яєчна суміш середовища Левенштейна-Єнсена.
До сольової основи середовища Левенштейна-Єнсена додають NaCl із розрахунку 5,0 г на 100,0 мл сольової основи (5,0 %). Отриманий розчин стерилізують за температури +121 ° C 20 хв. Потім готують середовище, як зазначено в рецепті приготування середовища Левенштейна-Єнсена.
На всі зазначені вище середовища засівають по 0,2 мл зависі дослідної культури.
На підставі відсутності росту на діагностичних середовищах із саліциловокислим натрієм або ПНБК утворення сформованих непігментованих колоній протягом 3-4 тижнів за температури +37 ° C досліджену культуру можна віднести до M. tuberculosis complex.
Крім росту на цих середовищах, використовують здатність мікобактерій по-різному рости на рідких живильних середовищах. НТМБ ростуть дифузно у вигляді кучок, на відміну від істинних туберкульозних мікобактерій, що ростуть плівкою, або придонно, мають корд-фактор і ростуть у вигляді «кіс», «джгутів», «вусів» - у тісному переплетенні окремих паличок одна з одною. Це може слугувати диференціальною ознакою. Проте стійкі до препаратів групи ГІНК (препарати групи гідразиду ізонікотинової кислоти) M. tuberculosis цілком або частково втрачають корд-фактор. Тому для диференціації туберкульозних культур від НТМБ визначення корд-фактора потрібно використовувати в комплексі з іншими тестами.
Для того, щоб відрізнити М. tuberculosis від інших мікобактерій (М. bovis і НТМБ), використовують різноманітні біохімічні методи.
Видова ідентифікація M. tuberculosis complex має проводитися в усіх лабораторіях II і III рівнів. Найбільш актуальними представниками цього комплексу є М. tuberculosis, M. bovis і M. bovis-BCG, M. africanum, M. microti, M. caneti.
Їх видова ідентифікація заснована на фенотипічній характеристиці та біохімічних тестах, а саме:
тесту на наявність здатності продукувати нікотинову кислоту;
тесту на наявність нітратредуктазної активності;
тесту визначення здатності росту культури на середовищі з гідразид-тіофен-2-карбоксиловою кислотою (ТСН);
тесту визначення здатності до росту на середовищі з нікотинамідом;
тесту визначення чутливості до циклосерину;
тесту визначення каталазної і пероксидазної активності одночасно;
тесту на наявність термостабільної каталази;
реакції гiдролiзу твiну-80.
Ніацин продукують усі мікобактерії, але у M. tuberculosis у результаті блокування ряду метаболічних шляхів нікотинова кислота накопичується у великій кількості. Тому цей тест є одним з основних, що дає можливість відрізнити M. tuberculosis від інших мікобактерій.
Принцип методу полягає у визначенні нікотинової кислоти хімічними методами в живильному середовищі, але не у власне мікобактеріях, за допомогою ціаністих сполук, з якими нікотинова кислота дає яскраво-жовте забарвлення. Цей тест одержав назву ніацинового. Класичний метод засновано на використанні ціаністих сполук.
Зазначений метод визначення ніацину потребує для роботи застосування ціаністого калію, робота з яким має проводитися під витяжною шафою і потребує певних умов, що обмежує широке застосування цього тесту. У зв’язку із цим, на особливу увагу заслуговує метод визначення ніацину паперовими смужками, запропонований Кубика і Кильбурн, у модифікації Бараускене.
Перевага цього методу - у використанні роданистого калію замість ціаністого калію - речовини нелеткої і більш доступної для бактеріологічних лабораторій, а також у швидкості реакції, яка дозволяє через 3-4 год дати відповідь про належність культури, що виросла на щільному середовищі, до M. tuberculosis або до інших мікобактерій.
Принцип методу полягає в екстракції ніацину з мікобактерій дистильованою водою і визначення його за допомогою паперових смужок, які заздалегідь обробляють відповідними реактивами.
Приготування реактивів:
20,0 % розчин пара-аміносаліцилової кислоти (ПАСК):
у пробірку наливають 1,75 мл 95,0 % спирту, 0,25 мл диметилсульфоксиду (димексиду) і додають 400,0 мг ПАСК. Суміш підігрівають на водяній бані за температури 56 ° C протягом 5-10 хв з періодичним струшуванням до повного розчинення ПАСК;
60,0 % розчин роданистого калію:
наважку 1,5 г роданистого калію розчиняють у пробірці з 2,5 мл 8,0 % розчину лимонної кислоти (200,0 мг лимонної кислоти і 2,5 мл дистильованої води);
50,0 % розчин хлораміну «Б»:
3,125 г хлораміну «Б» розчиняють у 6,25 мл дистильованої води на водяній бані за температури 56-60 ° C зі струшуванням. Гарячий розчин капають на смужки.
Індикаторні смужки готують із фільтрувального паперу Filtrak 11. Один кінець смужки, розміром 60,0 × 8,0 мм, позначають простим олівцем. Пастерівськими піпетками на папір наносять по одній краплі свіжоприготованих реактивів у такому порядку: 20,0 % розчин ПАСК - на позначений олівцем кінець, 60,0 % розчин роданистого калію - посередині смужки і 50,0 % розчин хлораміну «Б» - на інший кінець. Між краплями мають залишатися сухі проміжки. Папірці висушують за кімнатної температури в темряві протягом 24 год, після чого зберігають їх у холодильнику в пробірках, що загвинчуються, або закритих гумовими корками. Індикаторні смужки залишаються активними протягом трьох місяців. Для одержання більш чіткої реакції рекомендують наносити повторно одну краплю хлораміну «Б» на вже висохлу краплю.
Для тесту використовують 3-4-тижневі життєздатні культури (не менше ніж 50 колоній) у середовищі Левенштейна-Єнсена.
Екстракт мікобактерій одержують шляхом додавання до пробірки з культурою 1,0-1,5 мл дистильованої води або ізотонічного розчину натрію хлориду і витримування пробірок у горизонтальному положенні, щоб усі колонії добре відмилися водою протягом 30 хв у термостаті. Якщо культура росте «газоном», поверхню середовища потрібно злегка проткнути піпеткою для того, щоб збільшити контакт дистильованої води чи ізотонічного розчину натрію хлориду із середовищем. Потім 0,6 мл екстракту мікобактерій відсмоктують мірною піпеткою до пробірки.
Індикаторну смужку поміщають кінцем, поміченим олівцем, до пробірки з 0,6 мл досліджуваного екстракту мікобактерій. Пробірку закривають пробкою та витримують за кімнатної температури, періодично струшуючи, поки вся смужка не просочиться екстрактом. У разі позитивного ніацинового тесту через 15-30 хв рідина забарвлюється в яскраво-жовтий колір. Дегазація пробірки після проведення реакції здійснюється шляхом додавання 10,0 % розчину нашатирного спирту.
Використання паперових смужок для визначення ніацину дає можливість застосовувати цей тест в усіх практичних лабораторіях.
Наразі існують комерційні набори готових паперових смужок, крапельних наборів для проведення ніацинового тесту, що значно його спрощує і стандартизує.
Потрібно пам’ятати, що ряд НТМБ - M. simiae, M. chelonae і деякі штами M. marinum також блокують ніацин. Хромогенні штами НТМБ можуть давати хибнопозитивні реакції.
Негативний результат не є остаточним, оскільки культури M. tuberculosis, виділені від хворих, які тривалий час одержують протитуберкульозні препарати, слабо продукують ніацин. У подібних випадках потрібно повторити тест, а культуру пересіяти, щоб одержати пишний ріст, і використати для тестування 3-4-тижневу культуру.