Диференціацію M. tuberculosis complex (M. tuberculosis M. bovis, M. bovis BCG, M. africanum, M. microti) й ідентифікацію НТМБ рекомендують проводити з використанням молекулярно-генетичних методів дослідження.
Використання молекулярно-генетичних методів для ідентифікації мікобактерій базується на гібридизації ДНК дослідного штаму зі специфічними для виду мікобактерій ДНК-зондами. Застосування молекулярно-генетичних методів дозволяє проводити ідентифікацію мікобактерій упродовж декількох робочих днів.
14. Найбільш ефективними визнано молекулярно-генетичні методи, що базуються на гібридизації з ДНК-зондами (Line Probe Assay, LPA), зокрема GenoType Mycobacterium CM/AS, GenoType MTBC, INNO-LiPA Mycobactera. Технологія проведення досліджень із використанням цих методів включає такі етапи:
виділення ДНК з культур мікобактерій;
ПЛР для ампліфікації фрагментів генів мікобактерій;
гібридизацію ПЛР-продуктів із ДНК-зондами, які іммобілізовані на смужці;
візуалізацію результатів гібридизації (при цьому визначається належність мікобактерій до певного виду).
Тест GenoType Mycobacterium CM (Common Mycobacteria) ґрунтується на технології DNA-STRIP, що дає змогу ідентифікувати такі види мікобактерій: M. avium ssp., M. chelone, M. abscessus, M. fortuitum, M. gordonae, M. intracellulare, M. scrofulaceum, M. interjectum, M. kansasii, M. malmoense, M. peregrinum, M. marinum/M. ulcerans, комплекс M. tuberculosis та M. xenopi.
Процедура проведення тесту складається з таких етапів:
виділення ДНК із культур, що виросли на щільному або рідкому поживному середовищі;
мультиплексна ампліфікація з біотинильованими праймерами;
реверс-гібридизація.
Гібридизація охоплює такі етапи:
хімічна денатурація продуктів ампліфікації;
гібридизація одноланцюгових ампліконів, які помічені біотином, на мембранозв’язаних зондах;
ретельне промивання;
додавання кон’югату стрептавідину / лужної фосфатази (реакція забарвлення).
Вихідним матеріалом для тесту виділення ДНК можуть бути бактерії, які виросли на щільному живильному середовищі (наприклад, Левенштейна-Єнсена) або на рідкому середовищі (наприклад, у системі BACTEC).
Тест не підходить для детекції мікобактерій із прямого матеріалу пацієнтів.
Методика виконання:
під час роботи з бактеріями, які виросли на щільному середовищі, потрібно зняти колонії аплікатором і перенести їх до 300 мкл деіонізованої води до пробірки з кришкою, що загвинчується;
під час роботи з бактеріями, які виросли в рідкому середовищі, потрібно відібрати 1 мл, центрифугувати протягом 15 хв за 10 000 g у центрифузі з аерозоль-непроникним ротором. Супернатант злити, а осад із бактеріями ресуспендувати на вортексі в 300 мкл деіонізованої води в пробірці з кришкою, що загвинчується;
інкубувати пробірки з бактеріями на водяній бані 20 хв за температури +95 ° С;
обробляти пробу в ультразвуковій бані протягом 15 хв;
центрифугувати пробу на максимальній швидкості 5 хв, а для ПЛР використовувати 5,0 мкл супернатанту. Якщо передбачається більш тривале зберігання, розчин ДНК потрібно перенести до нової пробірки.
Можна використовувати інші методи виділення ДНК, які дають змогу отримати з бактерій ДНК для ампліфікації.
Готувати ампліфікаційну суміш (по 45,0 мкл) потрібно в чистій від ДНК кімнаті. Зразки ДНК треба вносити до пробірки із сумішшю також в окремому приміщенні.
Мікс на одну пробірку:
35,0 мкл PNM;
5,0 мкл 10-кратного полімеразного буфера для інкубації;
х мкл розчину MgCl 2 ;
1-2 одиниці термостабільної ДНК-полімерази;
у мкл води для доведення об’єму до 45,0 мкл;
для отримання кінцевого об’єму 50,0 мкл додати 5,0 мкл розчину ДНК (20,0-100 нг ДНК).
Залежно від системи фермент/буфер, що використовується, оптимальна концентрація MgCl 2 може коливатися між 1,5 та 2,5 мМ (деякі інкубаційні буфери вже містять MgCl 2 ).
Під час використання HotStar ДНК-полімерази від Qiagen для одного зразка потрібно взяти такі реагенти:
35,0 мкл PNM;
5,0 мкл 10-кратного ПЛР буфера для HotStar Tag (містить 15 мМ MgCl 2 );
2,0 мкл 25 мМ розчину MgCl 2 ;
0,2 мкл (1,0 од) HotStar Tag;
3,0 мкл води (для молекулярно-біологічних досліджень);
5,0 мкл розчину ДНК.
Кінцева концентрація MgCl2 у цій ампліфікаційній суміші становить 2,5 мМ.
Визначають кількість зразків для ампліфікації (кількість дослідних проб + контрольні зразки). Проба контролю контамінації (негативний контроль) містить 5,0 мкл води замість розчину ДНК. Підготовляють мастер-мікс, що містить усі реагенти, за винятком розчину ДНК, і добре перемішують (не на вортексі!).
Аліквотують по 45 мкл до кожної підготовленої ПЛР-пробірки.
Програма ампліфікації:
15 хв 95 ° C 1 цикл
30 с 95 ° C } 10 циклів
2 хв 58 ° C }
25 с 95 ° C }
40 с 53 ° C } 20 циклів
40 с 70 ° C }
8 хв 70 ° C 1 цикл
Продукти ампліфікації можуть зберігатися за температури від +8 ° C до +20 ° C.
Процедура виконання гібридизації:
попередньо нагріти водяну баню із шейкером/TwinCubator до температури 45 ° C, до максимально допустиме відхилення від заданої температури ±1 ° C. Попередньо підігріти розчин HYB та STR до температури 37-45 ° C перед використанням. Реагенти мають бути вільні від осаду. Нагріти всі інші реагенти, за винятком CON-C та SUB-C, до кімнатної температури. За допомогою відповідного дозуючого приладдя розчинити концентрат кон’юганта (CON-C, помаранчевий) та концентрат субстрату (SUB-C, жовтий) у співвідношенні 1 : 100 у відповідних буферах (CON-C у CON-D та SUB-C у SUB-D) у потрібній кількості. Добре перемішати та довести до кімнатної температури. Із розрахунку на кожну смужку додати 10 мкл концентрату до 1 мл відповідного буфера. Розводити CON-C потрібно перед кожним використанням. Розчинений SUB-D можна зберігати протягом чотирьох тижнів за кімнатної температури в захищеному від світла місці;
розлити по 20,0 мкл розчину для денатурації (DEN, блакитного кольору) в куток кожної лунки;
додати 20,0 мкл продукту ампліфікації, перемішати піпетуванням та інкубувати 5 хв за кімнатної температури;
витягти смужку з пробірки за допомогою пінцета та помітити її олівцем на зворотному боці в забарвленому місці. Під час роботи зі смужками завжди використовувати рукавички;
обережно додати до кожної лунки 1,0 мл попередньо нагрітого буфера для гібридизації (HYB, зелений). Перемішати лоток до отримання гомогенного забарвлення. Потрібно дотримуватись обережності, щоб не пролити розчин у сусідні лунки;
помістити смужки до лунки. Смужки мають бути повністю занурені в розчин та розміщені лицьовим боком (можуть бути розрізнені за кольоровим маркером на нижньому краї) угору. Перегорнути стрічку, якщо зайняла хибне положення під час занурення, за допомогою пінцета. Потрібно обережно промивати пінцет після кожної операції для запобігання забрудненню. Це правило має бути обов’язковим для всіх наступних кроків;
помістити плашку на вібруючу водяну баню для перемішування/ TwinCubator та інкубувати 30 хв за температури 45 ° C. Довести частоту вібрації у водяній бані до потрібного постійного та ретельного перемішування. Для досягнення відповідного передання тепла плашка має бути занурена у воду щонайменше на третину товщини;
повністю видалити буфер для гібридизації. Наприклад, використовуючи пастерівські піпетки, що під’єднані до вакуумного насоса;
додати 1,0 мл буфера для жорсткої відмивки (STR, червоний) до кожної лунки та інкубувати 15 хв за температури 45 ° C у водяній бані із шейкером/ TwinCubator;
працювати за кімнатної температури у всіх наступних кроках.
Повністю видалити буфер для жорсткої відмивки.
Вилити відмиваючий буфер до широкого контейнера та видалити всі остаточні рідини способом перегортання плашки та обережним промокуванням її адсорбуючим папером. Ця процедура застосовується для всіх інших стадій промивання:
промити кожну смужку один раз із 1,0 мл відмиваючого розчину (RIN) на вібруючій платформі/ TwinCubator (вилити RIN після інкубації);
додати 1,0 мл розчиненого кон’юганта (див. вище) до кожної смужки та інкубувати 30 хв на вібруючій платформі/TwinCubator;
видалити розчин та промити кожну смужку двічі протягом 1 хв у відмиваючому розчині та 1 хв у дистильованій воді (тобто струменем із пластикової пляшки) на вібруючій платформі/TwinCubator (видаляти розчин кожного разу). Переконатися, що видалено будь-які залишки води після останнього промивання;
додати 1,0 мл розведеного субстрату (див. вище) до кожної смужки та інкубувати в захищених від світла умовах без вібрації.
Залежно від умов тестування (кімнатної температури) час інкубації субстрату може змінюватися від 3 хв до 15 хв. Збільшений час інкубації субстрату призведе до збільшення фонового сигналу та може вплинути на інтерпретацію результатів;
зупиняти реакцію швидким подвійним відмиванням дистильованою водою;
за допомогою пінцета дістати смужки з плашки та висушити їх між двох шарів адсорбуючого паперу.
Для оцінки та інтерпретації результатів смужки потрібно наклеїти на бланк-шаблон і зберігати в захищеному від світла місці. Еталон для оцінки додається до набору.