Для отримання фосфатного буфера (рН = 6,8) готують два розчини:
9,47 г безводного Na 2 HPO 4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води;
9,07 г KH 2 PO 4 розчиняють в 10,0 мл дистильованої води.
Потім для приготування буфера з рН = 6,8 обидва приготовані розчини змішують у рівній кількості й перевіряють рівень рН за допомогою рН-метра або індикаторної паперової смужки. Потрібного значення рН досягають, додаючи розчин а чи б. Розчин а підвищує значення рН, розчин б - знижує.
Другий варіант приготування буферного розчину: в 10,0 мл дистильованої води потрібно розчинити:
двозаміщений фосфат натрію (Na 2 HPO 4 ) - 4,74 г;
однозаміщений фосфат калію (KH 2 PO 4 ) - 4,54 г.
Стерилізація буфера проводиться в автоклаві за температури +121 ° C протягом 15 хв у ємності з кришкою, що частково відкручена. Після охолодження розчину до кімнатної температури кришку слід щільно закрутити.
Обробку матеріалу слід проводити в ламінарній шафі біобезпеки з дотриманням стерильності за такою схемою:
до зразка (приблизно 5,0-10,0 мл), який міститься в пластиковій градуйованій центрифужній пробірці на 50,0 мл, додати рівний об’єм NALC-NaOH;
щільно закривши кришку, змішати вміст пробірки струшуванням або за допомогою вортексу (протягом 5-20 с) до повного розрідження;
перевернути пробірку, щоб усі ділянки її внутрішніх поверхонь і кришки піддалися дії розчину.
Потрібно уникати посиленого струшування, щоб запобігти окисленню й інактивації NALC. Необхідний ступінь інтенсивності змішування деконтамінуючого розчину з оброблюваним матеріалом забезпечується під час центрифугування, для чого потрібно:
залишити зразок на 15 хв за кімнатної температури для деконтамінації (у разі якщо потрібно збільшити ступінь деконтамінації, час експозиції може бути продовжено до 25 хв);
додати до пробірки стерильний фосфатний буфер (рН = 6,8) до відмітки «50,0 мл» (для зниження дії NAOH і зменшення щільності розчину перед центрифугуванням);
щільно закрити кришку й перемішати вміст пробірки струшуванням, щоб змити всі внутрішні поверхні пробірки і кришки;
центрифугувати зразок протягом 15-20 хв за 3 000 g в антиаерозольній центрифузі для осадження 95,0 % наявних у матеріалі мікобактерій;
перелити надосадову рідину в ємність з дезінфікуючим розчином за допомогою стерильної піпетки (або злити супернатант в ємність з дезінфектантом, після чого витерти край пробірки серветкою, змоченою дезінфектантом, або акуратно обпалити), а потім закрити пробірку.
Потрібно додати до осаду 0,5-2,0 мл нової порції стерильного фосфатного буфера, а потім ресуспендувати осад і використовувати його для інокуляції.
Розчин тризаміщеного фосфорнокислого натрію може використовуватися в 10,0 % концентрації.
Тризаміщений фосфорнокислий натрій (Na 3 PO 4 ) добре пригнічує супутню флору і навіть при 2-3-денному зберіганні матеріалу за температури +4 ° C не пошкоджує мікобактерій і мало впливає на їх здатність до росту на живильних середовищах.
Тризаміщений фосфорнокислий натрій може використовуватися для консервації, транспортування і деконтамінації зразків мокротиння. Метод не має жорстких обмежень за часом. Цей метод обробки матеріалу використовується тільки для посіву на щільні живильні середовища.