Флуорохромні барвники (аурамін О, родамін С тощо) зв’язуються з воскоподібними структурами бактерійних клітин, які під час опромінення ультрафіолетовими променями візуалізуються як палички жовтого або помаранчевого кольору на темному фоні.
Перевага флуоресцентного методу мікроскопії полягає в можливості перегляду більшої площі мазка, що пов’язано з використанням об’єктива з меншим збільшенням.
Аурамін має канцерогенну активність, тому не слід допускати попадання на шкіру його порошку або розчину. Зважувати аурамін потрібно у вінілових рукавичках або двох парах звичайних рукавичок та захисних окулярах. Для захисту дихальної системи потрібно використовувати респіратор. Приміщення після зважування слід провітрювати. Готувати розчин і проводити забарвлення мазків варто тільки у витяжній шафі.
Під час забарвлення мазків флуорохромними барвниками потрібно:
уникати неповного знебарвлення;
готувати досить тонкі мазки, оскільки зайва товщина мазка перешкоджає якісному знебарвленню, а додаткове дофарбовування може під часховати наявність мікобактерій. Окрім цього, товсті мазки погано фіксуються на предметному скельці, а тому можуть бути змиті в процесі фарбування;
уникати надмірно інтенсивного дофарбовування, яке приховує наявність мікобактерій.
Оскільки із часом флуоресцентне забарвлення може зблідніти, мікроскопію роблять за можливості відразу ж після закінчення процедури забарвлення і висихання мазків. У разі неможливості проведення мікроскопії безпосередньо після фарбування допускається зберігання забарвлених мазків у темному місці, бажано в холодильнику, не більше ніж 24 год.
Реактиви:
1. Забарвлюючий розчин
Розчин 1. Спиртовий розчин аураміну О:
аурамін
- 0,1 г
Аурамін розчиняють у 96 ° етиловому спирті
- 10,0 мл
Розчин 2. Розчин фенолу:
фенол кристалічний
- 3,0 г
дистильована вода
- 87,0 мл
Кристали фенолу (температура плавлення - +41 ° С) розчиняють у дистильованій у воді, підігріваючи на водяній бані.
Робочий розчин:
У витяжній шафі змішують розчини 1 і 2, переливають у ємність із темного скла, що щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату притування і термін зберігання.
Розчин можна зберігати в ємності з темного скла в прохолодному затемненому місці впродовж трьох місяців, у процесі зберігання розчин може стати каламутним, проте це не впливає на якість фарбування.
Знебарвлюючий розчин (розчин 0,5 % солянокислого спирту):
Концентрована соляна кислота - 0,5 мл
96 ° етиловий спирт - 100,0 мл
Акуратно додають концентровану соляну кислоту в етиловий спирт. Слід обережно влити кислоту в спирт, але не навпаки. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування, термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.
Для дофарбовування можна використовувати розчини перманганату калію, акридинового помаранчевого або метиленового синього.
Розчин перманганату калію:
Перманганат калію (КMnО 4 ) - 0,5 г
Дистильована вода - 100 мл
Перманганат калію розчиняють у дистильованій воді і переливають у бутель з темного скла, який щільно закривається. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.
Розчин акридинового помаранчевого:
Безводний двозаміщений фосфат натрію (Na 2 HPO 4 ) - 0,01 г;
Акридиновий помаранчевий - 0,01 г;
Дистильована вода - 100 мл.
Фосфат натрію розчиняють у дистильованій воді. Додають акридиновий помаранчевий. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.
Розчин метиленового синього:
Метиленовий синій хлорид - 25,0 мг;
Вода дистильована - 100 мл.
25,0 мг метиленового синього хлориду розчиняють у 100 мл дистильованої води. На етикетці зазначають назву реактиву, дату приготування і термін зберігання. Розчин можна зберігати в ємності з темного скла за кімнатної температури впродовж трьох місяців.